理学]第7章色谱分离过程2011pptx

  第7章色谱分离过程;? 7 .］概述;?色谱分离过程具有如下特点。 ⑴应用场景范围广;⑵分离效率高 ? 若用理论塔板数来表示色谱柱的效率，每米 柱长可达几千至几十万的塔板数，特别适合于 极复杂混合物的分离，且通常收率、产率和纯 度＞都较咼O ?⑶操摒 0°cncom ? 在色谱分离中，可通过选不一样的操作模 式，以适应任何不同样品的分离要求。;?如可选择吸附色谱、分配色谱和亲和色谱等不 同的色谱分离方法;可选择不同的固定相和流动 相状态及种类；可选择间歇式和连续式色谱。 (4 )高灵敏度在线检测I ? 在分离与纯化过程中，可依照产品的性质, 应用不同的物理与化学原理，采用不间的高灵 敏度检测器进行连续的在线检测。来保证了 在达到一定的要求的产品纯度下，获得最高的产率。;? 7. 2色谱分离过程的基础原理 ? 7. 2. 1分离原理 ? 色谱分离过程的实质是溶质在不互溶的固 定相和流动相之间进行的一种连续多次的交 换过程，它借助溶质在两相间分配行为的差 别而使不同的溶质分离。不同组分在色谱过 程中的分离情况首先取决于各组分在两相间 的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差 异。图7-1是对色谱分离过程原理的简单图示。;1溶刑糸品;? 7.2.2固定相（色谱柱填料） ? 色谱柱填料分为球形颗粒填料和不规则 形状颗粒填料，前者具有较大的优势。它 有较高的机械强度，不易破碎，柱的填装 重现性好，并可增加样品在柱中的渗透性: 虽价格较高侣其常规使用的寿命较长。选择合 适的柱填料不仅应考虑其化学性质，还应 考虑颗粒大小、色谱柱长度、操作压力等 因素，才能得到好的分离效果。;? （1）硅胶衍生的固定相;可用于葡萄糖和果糖的分离及蛋白 质的分离与提纯。质子化的强离子交换 树脂能用于分离高度氧化及脱水的二幅 类化合物。;? (3)大孔吸附树脂;? (4)凝胶 ? 根据凝胶的材料不同，可分为有机凝胶 和无机凝胶。有机凝胶一般是交联的高聚 物，根据其交联度的大小可以溶胀，柱的 效率离，但易老化，耐热性和机械强度 都较差。无机凝胶的柱分离效率较差，但 性能稳定易于掌握」亲水性凝胶用于生化 产品的分离，亲油性和两性凝胶适用于合 成高分子材料的分离???;? (5)手性固定相;? 7. 2. 3色谱柱及柱技术 ? 色谱柱是色谱技术的核心，因为无论 应用何种色谱方法，样品都是在色谱柱中 实现分离的。制备型色谱柱尺寸大，且负 载样品量大，因而制备色谱柱成为制备色 谱^WW^Iocin com ? 色谱柱的性能依赖于三个因素：色谱柱 填充技术、柱设计和生产。;? (1)色谱柱装填方法 ? 色谱柱装填方法一般有五种，高压匀浆 填充、干法填充、径向压缩法、轴向压缩法 和环形压缩技术。而对于中型或大型制备色 谱柱的装填主要是采用后三种方法，如图7-2所 示。轴向压缩法又分为动态轴向压缩法(DAC) 和普通轴向压缩法，二者的不同之处在于在DAC法 中，色谱柱在使用的过程中仍保持一定的压力 从而处于压缩状态。;3)径向压缩法 (b)轴向压缩法 讦向圧缩法;动态轴向压缩法的基础原理是利用一 可移动的活塞将装入色谱柱的填料匀浆压 实，在洗脱过程中，色谱柱柱床从始至终保持 一固定的压力，来保证柱床维持稳定、 均匀且没有空隙形成。DAC技术解决了色谱 法放大过程中，庆直径色谱柱的装填问题 且能保证稳定的柱效能，最大的动态DAC色 谱柱内径达16oomm0;? (2)色谱柱设计 ? 柱设计是影响色谱柱性能的重要的条件。因 为柱设计直接影响到能否在色谱柱中形成液体 的平推流式分布。目前在工业规模的连续多柱 制备色谱系统中，色谱柱多采用大直径，短柱 长的Mv#0docin com ? 柱头结构与分析柱完全不同，它的设计显 得特别的重要。;? 例如，在柱端口，当溶剂进入色谱柱 后,溶剂流速通常要降到原来的1/200, 因此要保证柱端的优化设计。首先利用 流体力学模型进行模拟计算，达到最佳 柱端设计，然后再进行放大，以使被分;柱结构的设计上，传统的轴向流动柱是;7. 3色谱的分类 才艮据分离样品量的不同，可分为： A、 半制备，微克级至克级。 B、 大规模，克级至千克级。 C、 生产，克级至千克级。 根据制备与生产中应用的色谱设备 A、 动态轴向压缩色谱。 B、 扩展床吸附色谱。 C、 模拟移动床色谱。 D、 超临界流体色谱。;才艮据溶剂和固定相之间的相互作用 机理可分为 ?①分子排阻色谱(SEC)或凝胶(GC)过滤色谱 ? SEC是以凝胶为固定相，一种根据各物质分子 大小不同而进行分离的色谱技术。凝胶具有一 定范围的孔尺寸，大分子进不去而先流出色谱 柱，小分子后流出色谱柱，从而将混合组分分 离。在以水系统为流动相时又称为GC。;?②离子交换色谱IEC ? IEC以阳离子和阴离子交换树脂为固定相， 依据各种离子对离子交换树脂的相对亲和力不 同，而在色谱柱上分离成不连续的谱带，一次 洗脱流出色谱柱。该法适合于离子和在溶剂中 可发生电离的物质的分离。大多数生物大分子 都是极性的，可使其电离，所以IEC大范围的使用在 生物大分子的制备分离。尤其是在蛋白质、多 肽、核酸等的分离纯化中占主导地位。;?③疏水作用色谱HIC。;?④亲和色谱AC。 ? AC是以亲和吸附剂为固定相，利用蛋白质分 子和适当的配位体能相互作用的生物化学特性进 行分离。亲和吸附剂是用一种能和蛋白质有特殊 粘连亲和专一作用的配基，接在疏水的载体上制 成的配基固定相。在适宜的缓冲液条件下进料， 利用冲洗液的组成和pH值的变化，使蛋白质和酶 一类的生物物质吸附而滞留，其他不能络合的杂 质流出柱外，再用缓冲液洗脱。载体必须是亲水 的均一、多孔网状结构，易于大分子渗透，有一 定化学稳定性，没有吸附能力的固体。;?⑤正相/反相色谱N/RPC。正相/反相色谱是根;? 7. 4色谱分离过程基础理论 ? 7.4.1保留值、分离度和柱效率;? tR:从进样开始到柱后出现样品的浓度极大值 所需的时问为保留时间，它与固定相和流动相 的性质、柱温、流速、柱体积等因素相关。;嘏磁肿计取的弑为;Rs=l时，两色谱峰的分离程度可达94% Rs=l. 5时，两个色谱峰已完全分离。 ? (3)柱效应 ? Martin在1941年提出了色谱的塔板理论, 把色谱柱比作蒸億塔。虽然这一理论没有 揭示出色谱过程的本质H却形象地描绘了 色谱过程的主要特征，并给出了衡量色谱 柱效率的指标一塔板高度和塔板数。;?实际在做的工作中，按以下公式计算塔板数(N)。;?理论板高度H为;17-71 (7-81;? 7. 4. 2色谱理论模型 ? 随着色谱技术的发展，为解释色谱 分离现象，指导色谱技术的发展，许多研 究者对色谱基础理论进行了不懈的研究，;? (1)平衡色谱理论;(7 9);? (2)塔板理论 ? 塔板理论将色谱过程比拟为蒸馅过程， 不同色谱柱看成是由一系列理论塔板所组成。 在一个理论板当量高度HETP的柱高内，溶质 在两相间达到一次平衡。由塔板理论可计算 理论塔板数及塔板高度［见式(7-6)］。 ? 在色谱柱足够长C理论塔板高度充分小 以及经性等温践条件下，塔板理论可以对色 谱流出曲线分布、谱带移动规律以及柱长等 对区域扩张的影响给予近似说明。;(3)轴向扩散理论 色谱的轴向扩散理论是Amudson等在大 量实验基础上提出的。这种理论认为：在色谱 过程中，组分在流动相中的轴向扩散是影响 色谱区域谱带扩张的重要的因素，而有限的传 质速率对区域谱带扩张没有影响。轴向扩散 理论的基本方程为;轴向扩散理论考虑了溶质于流动相 和固定相间的传质速率及流动相的流动 状态，当传质速率较快而轴向扩散为区 域扩张的重要的因素时，该理论具备比较好 的指导意义。;? 7.4. 3非线性色谱理论;将柱出口处谱带的浓度曲线同平衡等温线、 传质动力学方程和注入谱带曲线联立，通过 求解偏微分方程组以获得色谱同题的解。 平衡等温线、传质动力学方程、注入函 数和质量平衡方程构成了制备液相色谱过程 的数学模型。;? 7. 5典型制备色谱工艺及应用 ? 7. 5. 1模拟移动床色谱;? SMB色谱技术的优势 ? (1) SMB色谱是一个连续色谱分离过程。 ? 这个特点使得制备色谱分离过程实 现自动化操作和稳定的产品质量控制。 而且与传统间歇制备色谱相比，SMB色谱;(3) SMB色谱技术能实现旋光异构物分 离过程从分析型色谱条件快速、可靠地 放大至生产规模。 ? (4) SMB色谱装置可以适合不同规模的色 谱分离过程。;? 7. 5. 2扩展床吸附色谱 ? ( expanded bed adsorption, EBA) ? 7. 5. 2. 1 EBA色谱的基本原理和特点 ? EBA色谱的工作原理与一般的吸附色 谱相同.即通过装填的凝胶颗粒上结合的 功能基团与目标生物分子进行亲和吸附 静电吸附、疏水作用、金属鳌合作用等 产生吸附力.从而达到分离纯化目标生物 分子的目的。;但EBA色谱的工作过程与一般吸附色谱 不同。在EBA色谱分离过程中.凝胶颗粒随着 液相的上向流动而缓慢上升，凝胶颗粒间的 间隙逐渐扩大.凝胶柱床逐渐扩展.由于凝胶 颗粒间的间隙扩大。使样品中的细胞、细胞 碎片、颗粒等有形物质能够直接流穿而不会 堆积在凝胶柱床上造成堵塞。;可见EBA色谱与固定柱吸附色谱相比具;图7-7为色谱的工作过程示意图。如图所 示：凝胶颗粒柱在上向流动液体作用下向上 扩展，当上向的液相流速与凝胶颖粒的沉降 速度达到平衡时，凝胶颗粒处于平衡悬浮状 态。这时形成稳态流动柱床。;柱塞的位置处于柱床的顶部。接着将未 经离心、澄清过滤等处理的样品液上向注入 柱床，目标蛋白质吸附在凝胶颗粒上。而有 形颗粒直接穿过柱床，柱床随着液相上向流 动而得到冲洗.未被吸附的物质都流出床层， 这时停止上向流动液体。凝胶颗粒沉降下来. 柱塞也逐渐下降至沉降床层表面。然后以洗 脱液下向流动进行洗脱.得到目标蛋白质的浓 缩液.以便进行进一步纯化工作。洗脱完成后. 用适当的缓冲液对柱床进行再生。;? EBA色谱具有如下特点。 ? ①EBA色谱过程中.有形生物体可通过床 层。因此应用EBA色谱，可将生物工程下游纯 化技术中的离心、澄清、过滤等多步骤提取 过程简化为简单的一步色谱分离过程.大大简 化了工艺」缩短了提取时间C节约了生物工 程中下游纯化的资金投入。;?②EBA色谱是兼具批量吸附技术和填装吸附 色谱优点的实用技术，具有对原材料依赖性 低，吸附效率高的特点。因此，EBA色谱可在 短时间内对目标生物分子起到浓缩作用，且 分离过程中凝胶无损失，可重复使用，易于 控制，易于规模化等。;7. 5. 2. 2 EBA色谱常用固定相(凝胶)及选择原则 ? (1)常用EBA凝胶 ?①由Amersham Pharmacia Biotech公司专门设 计生产的Streaml ine系列凝胶是EBA色谱应用 中选用最多的凝胶种类。］ ?②Cetamic Hypet D系列为法国Biosepra公司 生产的EBA色谱用凝胶。;(2) EBA色谱的凝胶选择原则 ① 凝胶介质的颗粒大小和密度能使原材料的 生物体和吸附剂颗粒间的临界沉积流速产 生明显的区别。 ② 凝胶介质的颗粒大小和密度分布应使EBA扩 展过程尽量小的固液轴向混合。;③ 吸附剂应能耐受培养基中生物体、核酸、 脂类物质等的污染。, ④ 连接到吸附剂上的配基应足够稳定。 ⑤ 吸附剂的物质转移能力在E B A色谱应用中 足够有效。;? 7. 5. 2. 3 EBA色谱柱床的特征 ? (1)床层扩展的影响因素;图7-8所示为使用Streaml ine凝胶和未 修饰的琼脂糖吸附剂时，在不同流动相流;图7?X 不同疏連 卜很层柏对扩展琶度 . 为 ScrearnLine 異胺，* 为琼目旨鋪呢倒刑 〔含6% 琼脂肺.去核七材料八 阪杵尺飞r i(j(i—3nn“E ■;?这个结果也表明:;床层扩展后的 高度随着缓冲液体 系的不同而改变， 同时随着缓冲液流 速增加而增高。因 此，在EBA色谱应 用于黏度很大的原 料液时，密度和黏 度对床层的影响是 一个重要因素。;?⑵扩展床的吸附特性;BSA的穿遞曲线 吸附刑 Str^fiLmtinc OKAK ; 色辩在s 软充七 Pack XK16; EBA 0 请柱 Streamline： SG , StreamlEne 20G;?⑶扩展床操作压力 ? 通常填充床的床层空隙率为0.3-0. 4,;? (1)物理参数 ? 物理参数是指影响扩展床的流体力学性质 及床层稳定、均一流态化的因素。;另一方面则与操作条件有关，如操作温度、;? (2)化学参数 ? 化学参数是指影响分离过程选择性、 负载容量的因素。主要包括pH值、离子 强度、凝胶的特性、缓冲溶液种类等。;? 凝胶的特性直接影响EBA色谱行为，其中 包括凝胶颗粒的密度、平均直径、直径分布 范围以及凝胶的吸附能力、稳定性、孔径分 布等。如凝胶颗粒的密度与分离过程中原料;-7. 5. 3制备型超临界流体色谱(Pre-SFC ) ? (preparative supercritical fluid chromatography ) ? 7. 5. 3. 1超临界流体色谱的原理及特点;-o— 液态二 氧化碳;液体CO?通过泵注入装置①中，受热变为 超临状态CO?。在超临界条件下，分离过程在 色谱柱中完成。色谱柱中出口压力降低，co2 又成为气体状态，在气相中收集各流分。气体 CO?通过适当的设备得到净化、冷却后成为CO? 液体，流入贮罐中，继续循环使用。;?优势:;?③流动相回收简便。收集气相CO?通过一定设 备净化后可使其重返超临界状态，循环使用。 ?缺点： ?①技术昂贵。例如色谱柱的设计。色谱柱应能 承受相当高的压力变化，而且在色谱柱承受增 加的压力时要防止对填料的损坏。 ?②超临界CO?的溶解性能不可能溶解所有物质, 通常需加入改良剂改善溶解性能，但同时部分 抵消了其一些优势。;? 7. 5. 3. 2 Pre-SFC操作的特殊点 ⑴上样. ? 在Pre-SFC应用中，上样量主要受样品在超 临界流体中溶解度的影响，而不是色谱柱的负 载量。一般地，固体样品要先溶解在一定的溶 剂中形成样品溶液进行上样，但由于溶解样品 的溶剂可能在色谱柱中扩散，导致色带变宽， 因此直接进样的体积必须加以限制。若能除去 溶解样品的溶剂，则可克服这一缺点。;?①一种方法是使用前置柱上样。;?②另一种方法是对以上方法的改进。用一 个由50mm X 10mm I. D.收集柱构成的大容 量进样系统与分离柱连接；将样品溶液进 样，先用液态CO?稀释样品溶液，然后除去 溶剂土样品被收集在收集柱上；最后再将 收集柱上的样品溶解引入分离柱上。;? (2)流分的收集 ? 在完成超临界色谱分离后，收集被分离 物质的方法有以下几种： ?①解除超临界流体的压力； ?②在高压容器中收集，然后缓慢降压； ?③冷却收集容器，使co?固化;;om ?④吸附于一种固体上，然后用溶剂进行洗脱; ?⑤溶解在一种收集溶剂中。;? 7. 5. 4制备型加压液相色谱(Fre-PLC) ? 7. 5. 4.1基本操作原理 ? 制备型加压液相色谱一般为间歇式 操作，上样是间歇的，即样品进入色谱 系统后，必须完全流出色谱柱后才能进 行下一次的分离纯化过程。它的系统装 置组成如图7T5所示。;r;样品溶液由柱顶端加入色谱柱中，用泵 连续输入流动相，样品溶液中溶质在流动相 和固定相之间进行扩散传质，由于溶质各组;?⑴加样 ? 根据样品的溶解度不同可分为液体上样和 固体上样两种方式。 ? 液体上样方式中一般应尽可能选用流动相 溶解样品。在制备型色谱中，为提高生产能 力，需增加上样量，可采用增加样品体积和 提高样品溶液浓度两种方式。但如果样品体 积太大，色谱分辨能力就会下降，而如果样 品过浓，则可能在色谱柱的顶部形成沉淀。 在实际工作中，一般选择在小体积的流动相 中溶解较多样品。;固体上样是解决样品低溶解度的一 种方法。具体做法是将样品的干粉与柱 填料混合或预先吸附在填料上，然后加 至柱顶或将混合物加入分离柱前的前置 柱中。■―般每份样品需混入2 -一 5份柱填 料，当溶解度为5mg/nil以下时，每份样 品需混入5-10份柱填料。;? (2)流出液切割收集技术 ? 制备分离过程中，色谱柱在超载状态 下工作、样品的提纯量增加得比较大，需 采用切割收集技术，以增加单位时间的物 料通过量柵切割收集技术包括中心切割及 边缘切割两种方式，如图7—16所示。;? a与其他微量组分 完全分离，当色谱 柱超载时,主要色 谱峰a前后两端受 到微量组分的污染 需采用中心切割技 术得到纯组分a, 虽然会损失少量的 a,但高纯度a的产 量却可提高。 I;边缘切割技术则主要用于色谱系统的 选择性不足以将两个或多个相距很近的主要 成分进行分离中。如图中所示，在制备型色 谱分离时，通过切割所需成分相应色谱峰的 前部和后部获得纯a和纯b。对a和b的混合物 可重新进行分离，进一步获得纯品。如果一 次循环分离还未将a和b完全分开，则可重复 进行循环色谱分离。;德聰储健;? (3)产品回收和溶剂循环 ? 可采用蒸发溶剂、结晶、盐析沉淀等方法 将接近饱和的溶液继续浓缩，以从溶液中得 到固体产品。在沉淀过程中可能会形成颗粒 悬浮液，对此则需根据溶液体系的特点选择 沉降分离、微滤、旋液分离等方法回收这部 分???品。得到的固体产品还黏附有少量液体, 需视产品性质采用适宜干燥方法进行干燥， 如真空干燥、造粒干燥、冷冻干燥等。;对于结晶、盐析沉淀等过程中得到的溶液, 由于其仍为产品饱和溶液（不同条件下），可以 根据其浓度不同继续进行预浓缩和浓缩。而对 于蒸发过程所得溶剂及极稀的产品溶液，可通 过渗透蒸发和精信过程净化溶剂后，将溶剂重 新用于色谱分离过程。但如果产品的纯度要求 彳艮高，考虑到溶剂循环过程可能造成某些杂质 的积累，则需将这部分溶剂作为废液排放。因 此必须是在产品质量得到控制和保证的前提下 设计出适宜的溶剂循环过程。;色谱分离;? 7. 5. 4. 2动态轴向压缩(dynamic axial compression, DAC;) ?主要特点: ?①DAC色谱中使用动态轴向压缩色谱柱，柱 效很高。 I ?②DAC色谱从根本上解决了制备色谱技术的 放大问题.制备色谱的核心是色谱柱，要实 现工业化生产必须增加样品的负载量，这需 要使用大直径色谱柱??而如何装填大直径色 谱柱，提供高效、稳定的柱子是一个难点。;动态轴向压缩技术使得柱效不依赖 于柱直径的大小，这样就能轻松实现由分 析柱到制备柱的直接放大，而且色谱柱 床层的长短可通过改变固定相的使用量 进行调节。;? (1)动态轴向压缩色谱柱;? (2)动态轴向压缩色谱柱的装填;? ( 3 )动态轴向压缩色谱往的特性 ?①压缩的必要性。 动态轴向压缩色谱柱在使用过程中仍处 于压缩状态，这有利于床层稳定性的提高， 柱效保持稳定。，因为在填充过程结束后，床 层并未完全稳定，一些装填过程中形成的局 部不稳定区域仍存在，动态轴向压缩过程使 床层有一个逐步稳定的阶段，最终均一、稳 固。从而维持高的柱放。;②放大性能。 动态袖向压缩技术是解决放大问题的有效方法 在液相色谱中，经常用折合参数表示色谱柱的 效率，折合板高h定义为;?由图7-20中可以 看出，用不同直 径色谱柱进行实 验得到的数据吻 合很好，这表明 DAC色谱柱柱效 不依赖于其直径 的大小。;?③压缩压力对色谱柱的影响。;? 7.5.4.3应用挙例 ? 7 .6色谱分离技术展望;思考题 1、 色谱分离技术有何特点，适用于哪些产品的 生产过程？ 2、 如何认识色谱分离技术在工业应用过程中的 关键技术问题？ 3、 最具工业应用价值的色谱技术有哪些？ 4、 如何理解动态轴向压缩色谱技术的重要性？ 5、 模拟移动床色谱技术的特点及其意义是什 么？ ？

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